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Material und Methoden

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2.5 Gelelektrophorese

2.5.1 Beschreibung

Um Nukleinsäure-Moleküle zu trennen, sind die Gelelektrophoresen in Agarose

und Polyacrylamid am geeignetsten. Der Vorteil dieser beiden Verfahren liegt in

ihrem „Molekularsieb-Effekt“, bei dem die Moleküle in Abhängigkeit von ihrer

Größe wandern, wobei sich kleine Moleküle im Gel schnell und große eher

langsam bewegen. Da die Hauptladungsträger der Nukleinsäuren die

Phosphatgruppen sind und diese für jeden Nukleotidbaustein den gleichen pk-

Wert haben, hängt die Auftrennung zum einen nicht von Ladungsunterschieden

ab, zum anderen ist eine Trennung im Rahmen von pH-Wert-Unterschieden

wenig effizient.

Bei der Trennung von linearer, doppelsträngiger DNA erfolgt diese proportional

zum Molekulargewicht, da hier ein konstanter Ladungs-/Massen-Quotient

vorliegt. Anders ist dies bei relaxierter bzw. anders konformierter DNA, die

deutliche Unterschiede im Laufverhalten zeigt. Diese Tatsache macht sich die

SSCP-Analyse zunutze (siehe Kapitel 2.6).

Die Konzentration des Agarose-Gels wird durch die Länge des zu erwartenden

DNA-Fragmentes festgelegt. Ein DNA-Fragment mit einer Länge von 1000 bp-

15000 bp lässt sich am besten bei einer Agarose-Konzentration von 0,6% (w/v)

auftrennen. Gele mit höheren Konzentrationen eignen sich eher für den Bereich

von 100-2000 bp. Zur Darstellung einzelner Nukleotide sind hochkonzentrierte

Polyacrylamid-Gele erforderlich, die im Rahmen der molekulargenetischen

Arbeit bei Sequenzierungen zum Einsatz kommen.

Zur Elektrophorese gehören in der Grundform eine Elektrophoreseeinheit und

eine Spannungsversorgung (Gleichstrom). Die Elektrophoreseeinheit besteht

aus dem mit Puffer gefüllten Puffertank, in den das Gel vollständig eingetaucht

wird. Bei der Polyacrylamid-Gelelektrophorese wird das Gel zwischen zwei

Platten gegossen, sodass nur noch die freien Enden in die Pufferlösung

eintauchen. Die zwischen der Start- und Stopseite mittels Elektroden angelegte

Gleichspannung bewirkt eine Wanderung der negativ geladenen DNA-Moleküle

in Richtung der Anode. Die gewählten Laufbedingungen wie Stromstärke,

Pufferbedingungen und besonders die Konzentration des Trägermediums

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